優(you)秀文章源頭華廈酒報; 　β—葡(pu)萄(tao)糖苷(gan)(gan)酶(mei)又稱β—D—葡(pu)萄(tao)糖苷(gan)(gan)葡(pu)萄(tao)糖水(shui)解酶(mei)，它可以水(shui)解糖鏈末端非還原性的β—D—葡(pu)萄(tao)糖苷(gan)(gan)鍵。β—葡(pu)萄(tao)糖苷(gan)(gan)酶(mei)是纖維素酶(mei)的主(zhu)要組(zu)成(cheng)成(cheng)分(fen)，直(zhi)接影響著纖維素酶(mei)的降解能力。

　　此外(wai)，β—葡(pu)萄(tao)(tao)糖苷酶在食品行業(ye)中也有著廣(guang)泛的應用(yong)，如作(zuo)為水(shui)果和(he)茶葉的風味酶，水(shui)解大豆(dou)異(yi)黃酮(tong)甙元等(deng)。β—葡(pu)萄(tao)(tao)糖苷酶存在于(yu)自然界很多植物(wu)中，也存在于(yu)酵母、曲霉(mei)(mei)屬、木(mu)霉(mei)(mei)屬及一(yi)些(xie)細(xi)菌中。黑(hei)曲霉(mei)(mei)是(shi)公(gong)認(ren)安全的微生(sheng)物(wu)之一(yi), 在纖維物(wu)質(zhi)的誘導下，黑(hei)曲霉(mei)(mei)可產(chan)生(sheng)胞外(wai)β—葡(pu)萄(tao)(tao)糖苷酶。

　　筆者研究了黑曲霉固態發酵啤酒糟(zao)產β—葡(pu)萄糖(tang)苷(gan)(gan)酶的工藝條(tiao)件(jian)，同時(shi)探討了β—葡(pu)萄糖(tang)苷(gan)(gan)酶合成的動力學機制，望能為啤酒糟(zao)的再利(li)用(yong)提供一定數(shu)據(ju)(ju)依據(ju)(ju)。

    　1 材料和方法
    　1.1 菌種
    　黑曲霉購于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。
    　1.2 試劑和設備
    　1.2.1 主要試劑
    　啤酒糟由蚌埠學院生物與食品工程系啤酒發酵實驗室提供；
    　水楊苷（進口分裝）、微晶纖維素（進口分裝）、羧甲基纖維素鈉（CMC）、 3， 5—二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚。
    　1.2.2 主要設備
    　752分光光度儀(yi)（上海菁華科(ke)技儀(yi)器有限公司(si)）、DH Z—D冷凍恒溫振蕩器（江(jiang)蘇太倉市實驗設備(bei)廠）、SFAT—8000固態(tai)發酵罐（常州新區三(san)環生物工程成套(tao)設備(bei)有限公司(si)）。

    　1.3 培養基
    　斜面培養基：PDA培養基；
    　發(fa)酵培養基(ji)：啤酒糟5g置于500ml 三(san)角(jiao)瓶(ping)中，用(yong)基(ji)本培養液調初始含水量，121℃滅菌20min。

    　1.4 試驗方法
    　1.4.1 粗酶液的制備
    　黑曲霉在無菌條件下接入斜面培養基，30℃培養72h。每100ml  無菌水接入1環孢子配置種子懸浮液( 1.15×106 /ml )。按一定料液比將種子懸浮液接入滅菌后的發酵培養基中，培養96h。用100ml去離子水浸提培養基，攪拌1h，抽濾，在3000r/min條件下離心15min，收集上清液，即為粗酶液。
    　1.4.2 單因素分析
    　在其他條件不變的情況下，分別測定不同溫度、料液比和接種量對β—葡萄糖苷酶酶活的影響。
    　1.4.3 正交分析
    　利用L9( 34 )正交試驗優化β—葡萄糖苷酶的發酵條件。
    　1.4.4 動力學研究
    　發酵過程中，每隔24h分(fen)別測定發酵培(pei)養基中Cx 酶(mei)、β—葡(pu)萄糖(tang)苷酶(mei)和(he)C1酶(mei)的活性，分(fen)析(xi)β—葡(pu)萄糖(tang)苷酶(mei)酶(mei)活隨時間的變化情況。

    　1.5 酶活力的測定
    　1.5.1 β—葡萄糖苷酶活力的測定。取4支洗凈烘干的10ml具塞刻度試管， 編號后各加入1.5ml0.5%水楊酸苷檸檬酸緩沖液，向1號試管中加入1.5mlDNS溶液以鈍化酶活性，作為空白對照，比色時調零用。將4支試管同時在50℃水浴中預熱5min—10min，再各加入酶液0.5ml，50℃水浴中保溫30min，取出后立即分別向2、3 和4號試管中加入1.5ml DNS 溶液以終止酶反應，充分搖勻后沸水浴5min，取出冷卻后用蒸餾水定容至10ml，充分混勻。
 ;   　以1號試管溶(rong)液為(wei)空(kong)白對照調零點，測定2、3和4號試管液的吸光度值(zhi)并記錄結果。定義在測定條件(jian)下，1min內水解水楊(yang)酸苷生成1μmol葡萄(tao)糖所需(xu)的酶量為(wei)一個酶活單位（U）。

    　1.5.2 葡萄糖內切酶（CX）活力的測定 以羧甲基纖維素鈉為底物，方法同上。
    　1.5.3 葡萄糖外切酶（C1）活力的測定 以微晶纖維素為底物，方法同上。
    　1.5.4 還原糖的(de)測定 采用DNS（3，5—二硝基水楊(yang)酸）法。

    　2 結果(guo)與(yu)分析

    　2.1單因素分析
    　溫度(du)是(shi)黑(hei)曲霉生長(chang)的(de)重要條件之一(yi)，它不僅影響著(zhu)菌體的(de)生長(chang)速(su)率，同時(shi)也(ye)制約著(zhu)代謝產物的(de)水(shui)平。在(zai)30℃條件下，β—葡(pu)萄糖苷酶的(de)活力(li)最高，而40℃時(shi)酶活最低。值得注意(yi)的(de)是(shi)，從(cong)培(pei)養基孢(bao)子生長(chang)情(qing)況上看，25℃條件下，黑(hei)曲霉產生的(de)孢(bao)子稀疏，主要以(yi)菌絲體為(wei)主；而在(zai)37℃條件下，孢(bao)子生長(chang)的(de)十分密集(ji)，但兩者β—葡(pu)萄糖苷酶的(de)酶活相差不是(shi)很大。

    　這一現象表明，兩種產酶機制的不同，25℃更適合β—葡萄糖苷酶的生成，而37℃時，雖然產酶水平不高，但孢子數量巨大，產生的總酶活也高。
   ; 　在固態(tai)發酵中，初始(shi)含(han)水(shui)量(liang)主要影響著菌體對氧氣的攝取。按料液比（培養(yang)(yang)基(ji)：水(shui)，g/ml）1：5配(pei)置培養(yang)(yang)基(ji)的初始(shi)含(han)水(shui)量(liang)時酶(mei)活最(zui)高(gao)(gao)。當含(han)水(shui)量(liang)過(guo)高(gao)(gao)時，由于限(xian)制了(le)培養(yang)(yang)基(ji)對氧的攝取，產酶(mei)水(shui)平開始(shi)下降。

    　在一定范圍內，隨著(zhu)接種(zhong)量(liang)的(de)(de)增(zeng)(zeng)大(da)(da)，酶(mei)活逐漸(jian)變大(da)(da)，當(dang)接種(zhong)量(liang)增(zeng)(zeng)大(da)(da)到10%以(yi)上后，酶(mei)活變化減小，這可能是由(you)于菌(jun)種(zhong)數量(liang)過大(da)(da)，導(dao)致培養(yang)基營養(yang)成分的(de)(de)迅(xun)速消耗，從(cong)而影響酶(mei)的(de)(de)產量(liang)（見表2）。

    　2.2正交試驗優化發酵工藝
    　利用正交(jiao)表設計L9（ 34 ）正交(jiao)試驗(yan), 溫度的三個(ge)水(shui)平分(fen)別為25℃、30℃和(he)37℃；含水(shui)量分(fen)別為1：1、1：3 和(he)1：5；接種量為2%、5%和(he)10%（見表1）。

 ;   　可(ke)以看出, 在(zai)25℃、含水(shui)量1：5和接種(zhong)量10%的條件下(xia), 酶活達到10.85U / g；其中含水(shui)量對β—葡(pu)萄糖苷酶酶活具有顯著的線型(xing)相關（ p< 0.05）。

　　2.3 葡萄糖苷酶的合成特性
    　葡萄(tao)糖苷酶(mei)是纖維素酶(mei)的(de)重要組成(cheng)成(cheng)分，在(zai)很大(da)程度(du)上決(jue)定(ding)著纖維素酶(mei)的(de)活(huo)性(xing)。以啤酒糟(zao)為培養基，在(zai)30℃，接種量10%和料液比1：5的(de)條件(jian)下(xia)，利用固態發酵罐進行發酵，每隔(ge)24h測定(ding)黑曲(qu)霉產β—葡萄(tao)糖苷酶(mei)， 繪(hui)制各種酶(mei)的(de)酶(mei)活(huo)變化曲(qu)線(xian)。

    　Cx酶(mei)(mei)(mei)在(zai)(zai)72h時達(da)到產(chan)酶(mei)(mei)(mei)的(de)高峰期，而β—葡萄(tao)糖苷酶(mei)(mei)(mei)的(de)酶(mei)(mei)(mei)活(huo)則繼(ji)續增大。在(zai)(zai)96h后(hou)(hou)，β—葡萄(tao)糖苷酶(mei)(mei)(mei)酶(mei)(mei)(mei)活(huo)的(de)增幅(fu)變小，這一現象可能(neng)說明，在(zai)(zai)96h時該酶(mei)(mei)(mei)已經進入(ru)產(chan)酶(mei)(mei)(mei)的(de)高峰期；此后(hou)(hou)，由于(yu)(yu)菌絲(si)體發生自(zi)溶(rong)，胞內(nei)的(de)β—葡萄(tao)糖苷酶(mei)(mei)(mei)釋放到培(pei)養(yang)基(ji)中，使酶(mei)(mei)(mei)活(huo)進一步變大。利用啤酒糟(zao)作為培(pei)養(yang)基(ji)，β— 葡萄(tao)糖苷酶(mei)(mei)(mei)的(de)酶(mei)(mei)(mei)活(huo)要遠高于(yu)(yu)Cx酶(mei)(mei)(mei)，而用其它培(pei)養(yang)基(ji)時，Cx酶(mei)(mei)(mei)的(de)酶(mei)(mei)(mei)活(huo)要高于(yu)(yu)β—葡萄(tao)糖苷酶(mei)(mei)(mei)，這表(biao)明啤酒糟(zao)適合(he)于(yu)(yu)β—葡萄(tao)糖苷酶(mei)(mei)(mei)的(de)發酵生產(chan)。

    　3 結論

    　目前，β—葡(pu)萄(tao)糖(tang)苷酶主(zhu)要是利用微生(sheng)物發酵(jiao)進行生(sheng)產，尤其是黑曲霉和(he)米(mi)曲霉，培養基多為麩皮、蛋白胨(dong)和(he)各種(zhong)無(wu)機鹽。

　　有研究表明(ming)，初(chu)始pH值對(dui)于β—葡萄糖苷酶(mei)的產量有著重要的影響(xiang)。

    　啤酒(jiu)(jiu)糟富含各種營養成分，有利(li)于誘導β—葡萄(tao)糖(tang)(tang)苷(gan)酶的(de)(de)產(chan)生(sheng)，可能(neng)成為(wei)該(gai)酶發(fa)酵(jiao)生(sheng)產(chan)的(de)(de)天(tian)然培養基。實驗表(biao)明，在25℃，料液比1：5和接種量10%的(de)(de)固態發(fa)酵(jiao)條件下，酶活(huo)(huo)可達到10.85U / g；動力學研究顯示，β—葡萄(tao)糖(tang)(tang)苷(gan)酶在96h進入產(chan)酶高峰期，120h時達到酶活(huo)(huo)最高值。此外，發(fa)酵(jiao)后的(de)(de)啤酒(jiu)(jiu)糟由于纖維結構被(bei)破壞，從(cong)而更(geng)容易被(bei)動物吸收，可能(neng)成為(wei)較(jiao)好的(de)(de)有機飼料。