本(ben)文借鑒了一些(xie)植物多糖(tang)中單糖(tang)組分的分析方法，采(cai)用氣(qi)相色(se)譜(pu)法直接測定(ding)(ding)葡萄糖(tang)含(han)量，具有分析速度快、選擇性強、靈敏度高和測定(ding)(ding)結果精確可靠等(deng)優點，從而為(wei)啤酒酵母中β—葡聚糖(tang)含(han)量的測定(ding)(ding)提供新參考。

    　1  材料與方法

    　1.1 材(cai)料與試劑

    　啤(pi)酒酵母(mu)廣州市珠江啤(pi)酒廠(chang)；β—葡聚糖(tang)日本ADEKA株式(shi)會社(she)；風味蛋白酶、Alcalase2.4L 諾維(wei)信公(gong)司；丙酮、三氟乙(yi)酸、鹽酸羥胺、吡啶(ding)、乙(yi)酸酐等天津(jin)市化(hua)學試劑一廠(chang)，分(fen)析(xi)純；標準葡萄糖(tang)、甘(gan)露糖(tang) 上海源聚生物(wu)科技有限(xian)公(gong)司，分(fen)析(xi)純。

    　1.2 .1儀器(qi)與(yu)設(she)備

    　本實驗采用(yong)乙酰(xian)化(hua)作為(wei)衍(yan)生(sheng)化(hua)方法，其反(fan)應原理是：標(biao)準單糖和鹽酸羥胺在溶劑(ji)吡啶中加熱反(fan)應生(sheng)成糖肟，以(yi)乙酸酐(gan)作為(wei)乙酰(xian)化(hua)試(shi)劑(ji)，在加熱條件下繼續反(fan)應，最后生(sheng)成具有揮(hui)發性(xing)的(de)糖腈乙酸酯(zhi)衍(yan)生(sheng)物。

    　GC—2014 氣相色(se)譜儀(yi)配備氫火焰(yan)離(li)子化檢測器FID ，日本島津公(gong)司(si)(si)；KQ—250DE 型數控超(chao)聲清洗(xi)器，昆山市(shi)超(chao)聲儀(yi)儀(yi)器有(you)限公(gong)司(si)(si)；雷(lei)磁PHS—3C 精(jing)密pH 計，上海精(jing)科(ke)儀(yi)器有(you)限公(gong)司(si)(si)；N—EVAP111型氮吹儀(yi)，美(mei)國(guo)Organomation公(gong)司(si)(si)；5804R型高速(su)冷凍(dong)離(li)心機，德(de)國(guo)Eppendorf 公(gong)司(si)(si)；RE—52型旋轉蒸發儀(yi)，上海亞榮生化儀(yi)器廠；SHZ—D(III) 型循環水式真空泵(beng)，鞏義市(shi)予華儀(yi)器有(you)限責(ze)任公(gong)司(si)(si)；HHS型電熱(re)恒溫水浴鍋，上海博迅實業(ye)有(you)限公(gong)司(si)(si)醫(yi)療設備廠。

    　1.2 .2β—葡聚糖的制備(bei)

    　工藝(yi)流(liu)程：新(xin)鮮(xian)啤酒(jiu)(jiu)酵母(mu)→200目過篩除(chu)去(qu)啤酒(jiu)(jiu)花等雜質→水(shui)洗除(chu)去(qu)剩余啤酒(jiu)(jiu)→離(li)(li)(li)心(xin)分離(li)(li)(li)→將(jiang)沉淀(dian)溶于(yu)水(shui)配成(cheng)反(fan)應體(ti)系進行(xing)自(zi)溶→加鹽(yan)破壁→堿性蛋(dan)白酶(mei)酶(mei)解→離(li)(li)(li)心(xin)分離(li)(li)(li)→水(shui)洗沉淀(dian)→脫(tuo)色脫(tuo)脂(zhi)→冷凍(dong)干(gan)燥→粉(fen)碎(sui)→成(cheng)品

    　操(cao)作要點：自溶(rong)，在(zai)pH7.0環境(jing)中，按(an)反(fan)應(ying)(ying)體(ti)積(ji)1%的(de)(de)量加(jia)入風味蛋白酶，50℃下反(fan)應(ying)(ying)24h；破(po)壁，在(zai)pH10.5環境(jing)中，按(an)反(fan)應(ying)(ying)體(ti)積(ji)3%的(de)(de)量加(jia)入NaCl，攪拌(ban)混勻，80℃下保持1h；酶解，在(zai)pH10.5環境(jing)中，按(an)反(fan)應(ying)(ying)體(ti)積(ji)1%的(de)(de)量加(jia)入Alcalase2 .4L ，攪拌(ban)混勻，80℃下反(fan)應(ying)(ying)3h。

    　1.3.1β—葡(pu)聚糖(tang)和(he)甘露聚糖(tang)的單糖(tang)含量分(fen)析(xi)

　　方法制備的(de)β—葡聚糖(tang)(tang)成品中可能還有些其(qi)他物質，如甘(gan)露(lu)(lu)聚糖(tang)(tang)和蛋(dan)白(bai)質，其(qi)中甘(gan)露(lu)(lu)聚糖(tang)(tang)是由甘(gan)露(lu)(lu)糖(tang)(tang)構成的(de)同一聚糖(tang)(tang)，本(ben)實驗同時測定甘(gan)露(lu)(lu)聚糖(tang)(tang)的(de)含量(liang)(liang)，為β—葡聚糖(tang)(tang)含量(liang)(liang)的(de)測定提(ti)供參考。

    　準(zhun)確稱取(qu)10mg 固(gu)體單(dan)糖標準(zhun)品(pin)（先(xian)在105 ℃下烘干至(zhi)恒(heng)重(zhong)）、10mg 鹽酸羥(qian)胺于1.5mL小離(li)心(xin)管中，加入(ru)0.5mL吡啶，放入(ru)90℃水(shui)浴中加熱反應(ying)30min，間(jian)歇振蕩。取(qu)出(chu)后(hou)冷卻至(zhi)室溫，加入(ru)0.5mL乙酸酐，90℃下繼續(xu)水(shui)浴加熱反應(ying)30min，離(li)心(xin)后(hou)取(qu)適量上清液直接進行氣相色譜分析。

    　1.3. 2 葡萄糖和甘露糖標準曲線的繪制

 &好(hao)文章起源QQ華夏酒報nbsp;  　準確稱(cheng)取標(biao)準葡萄(tao)糖(tang)(tang)(tang)(tang)和甘露(lu)(lu)糖(tang)(tang)(tang)(tang)各10mg，乙(yi)酰化后，葡萄(tao)糖(tang)(tang)(tang)(tang)和甘露(lu)(lu)糖(tang)(tang)(tang)(tang)衍生(sheng)物濃(nong)度(du)同為10mg/mL，分別將此(ci)濃(nong)度(du)葡萄(tao)糖(tang)(tang)(tang)(tang)和甘露(lu)(lu)糖(tang)(tang)(tang)(tang)衍生(sheng)物按比例混合，配制成1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL和5mg/mL的混合糖(tang)(tang)(tang)(tang)液，同時做空(kong)白對照，立即進(jin)行氣(qi)相色(se)譜(pu)(pu)分析，記錄色(se)譜(pu)(pu)峰面積，以(yi)其為縱(zong)坐標(biao)，并以(yi)混合糖(tang)(tang)(tang)(tang)液中每種糖(tang)(tang)(tang)(tang)的濃(nong)度(du)為橫坐標(biao)，繪制標(biao)準曲線。

    　1.3.3 啤酒(jiu)酵母多糖的水解和衍生化(hua)準確稱取(qu)10mg多糖粉(fen)末于10mL離心試管中，加(jia)入(ru)2mL75%三(san)氟乙(yi)酸(suan)，封(feng)管，90℃下(xia)水浴(yu)3h，間歇振蕩(dang)，待酸(suan)水解完(wan)取(qu)出，將試管接(jie)入(ru)氮(dan)吹儀在80℃下(xia)蒸干，再加(jia)入(ru)1mL甲醇(chun)再次(ci)蒸干，重復(fu)3 次(ci)，以去除殘留三(san)氟乙(yi)酸(suan)。

    　1. 3.4 色(se)譜(pu)條(tiao)件

    　氣(qi)相色譜柱：DB—17 石英毛細(xi)管柱(30 m×0.32 mm，液膜厚0.25μm，Agilent) ；升(sheng)(sheng)溫程序：初溫為160℃，以5℃/min 升(sheng)(sheng)溫至180℃，再以2℃/min 升(sheng)(sheng)溫至210℃，保(bao)留5min ；進(jin)樣口溫度：230℃，檢測器(qi)溫度：250℃；

    　載氣(qi)（氮氣(qi)）流速：20mL/min，氫氣(qi)流速：45mL/min，空(kong)氣(qi)流速：400mL/min；分(fen)流比20：1，進樣量(liang)1μL。

    　乙(yi)酰化后，標(biao)準葡萄糖和甘露糖衍(yan)生(sheng)(sheng)物的氣相色譜分析結果如圖1 所示(shi)，分析表明采用糖腈乙(yi)酸(suan)酯衍(yan)生(sheng)(sheng)化的方(fang)法，一種單糖只(zhi)對(dui)應(ying)一種衍(yan)生(sheng)(sheng)化產物，在較低的200 ℃下即可分離出來。

    　兩種(zhong)標準單糖(tang)衍(yan)生物保留時間分(fen)別為14.347min和15.016min，分(fen)析表明(ming)在1. 3.4 所(suo)采用的氣相(xiang)色譜條件下(xia)，混(hun)合(he)單糖(tang)中的兩種(zhong)單糖(tang)出(chu)峰時間短，峰形(xing)對稱，隔得較開，并未出(chu)現(xian)拖(tuo)尾現(xian)象。

　　2  實(shi)驗分析

    　2 .1 兩種標準單糖衍(yan)生物的標準曲線

    　葡萄糖衍生(sheng)物標(biao)準(zhun)曲線（見(jian)圖1 ），甘露糖衍生(sheng)物標(biao)準(zhun)曲線（見(jian)圖2）。

　
    　根據標準(zhun)葡萄糖(tang)和甘露糖(tang)衍(yan)生物(wu)標準(zhun)曲線(xian)(xian)繪(hui)制的操(cao)作步(bu)驟。從曲線(xian)(xian)趨勢來看，兩(liang)種單糖(tang)衍(yan)生物(wu)出(chu)峰面積隨著糖(tang)濃度(du)的增大而(er)呈(cheng)線(xian)(xian)性增長。

    　2 .2 樣品水解單糖乙酰化產(chan)物的氣相色譜分析

    　ADEKA 株(zhu)式會社是日本最大的(de)β—葡(pu)聚糖(tang)生(sheng)產公司，這(zhe)里將其進口產品(pin)與本實驗室制(zhi)備的(de)成品(pin)中葡(pu)聚糖(tang)和(he)甘露(lu)聚糖(tang)含(han)量進行比較(jiao)，將兩種樣(yang)品(pin)水(shui)解并乙酰化(hua)后(hou)，按與混合標樣(yang)相(xiang)同的(de)色(se)譜(pu)分析條件進行氣相(xiang)色(se)譜(pu)分析，結果分別如圖(tu)4 和(he)圖(tu)5 所示，其水(shui)解單(dan)糖(tang)保(bao)留(liu)時(shi)間與標準(zhun)混合單(dan)糖(tang)的(de)保(bao)留(liu)時(shi)間對比分析表明，水(shui)解后(hou)的(de)兩種單(dan)糖(tang)分別為葡(pu)萄糖(tang)和(he)甘露(lu)糖(tang)，其中葡(pu)萄糖(tang)含(han)量較(jiao)高。β—葡(pu)聚糖(tang)水(shui)解衍生(sheng)化(hua)氣相(xiang)色(se)譜(pu)圖(tu)（見圖(tu)3）。

    　2 .3 啤酒酵母(mu)中(zhong)β—葡聚(ju)(ju)糖和(he)甘(gan)露聚(ju)(ju)糖的含量計算

    　根據(ju)樣品中(zhong)水解后每種單糖(tang)(tang)氣相分(fen)析的峰面積，代入葡萄(tao)糖(tang)(tang)和甘(gan)露(lu)糖(tang)(tang)的標準(zhun)曲(qu)線，可算(suan)(suan)出(chu)葡萄(tao)糖(tang)(tang)和甘(gan)露(lu)糖(tang)(tang)的濃度，進一步計(ji)算(suan)(suan)出(chu)樣品中(zhong)葡萄(tao)糖(tang)(tang)和甘(gan)露(lu)糖(tang)(tang)含(han)量，從(cong)而最(zui)終得到β—葡聚糖(tang)(tang)和甘(gan)露(lu)聚糖(tang)(tang)的含(han)量，所(suo)有(you)計(ji)算(suan)(suan)結(jie)果（見表(biao)1）。

    　從表(biao)1可(ke)以(yi)看出， 實驗室(shi)制備的β—葡聚糖(tang)和甘露聚糖(tang)與日本進口β—葡聚糖(tang)的含量都比(bi)較接近。樣(yang)品中組分(fen)測(ce)定的重現性實驗結(jie)果（見表(biao)2 ）。

    　根據2.3測(ce)定的(de)結(jie)(jie)果(guo)， 每(mei)10mg 樣品(pin)中β—葡聚(ju)(ju)糖和(he)(he)甘露聚(ju)(ju)糖含量分(fen)別為3.239mg和(he)(he)1.682mg，分(fen)別添加(jia)5mg葡萄糖和(he)(he)甘露糖進行(xing)測(ce)定，結(jie)(jie)果(guo)如(ru)表3所示，加(jia)標回收率(lv)為87.14%—101.2%，說(shuo)明該方法準確性(xing)高， 能夠(gou)滿足檢測(ce)要求。樣品(pin)中組(zu)分(fen)的(de)回收率(lv)實驗結(jie)(jie)果(guo)（見表3 ）。

    　3  結論

    　本實驗建立的啤(pi)酒酵母β—葡(pu)聚(ju)糖(tang)含量的氣(qi)相色譜測定法，前(qian)處理(li)簡單、操作(zuo)方(fang)便、重(zhong)現(xian)性好、選擇(ze)性強、精密度高，符合實驗室對β—葡(pu)聚(ju)糖(tang)含量測定方(fang)法的要求。

　　在這個分(fen)析過程中，要注意： 

　　第(di)一，糖(tang)類衍生化方(fang)法要(yao)求(qiu)制備簡便、試劑易(yi)得，而且每種(zhong)單糖(tang)要(yao)得到單一的色(se)(se)譜(pu)峰(feng)，這對(dui)單糖(tang)的定量分(fen)(fen)(fen)析是(shi)(shi)十分(fen)(fen)(fen)重(zhong)要(yao)的；第(di)二，色(se)(se)譜(pu)柱對(dui)于(yu)分(fen)(fen)(fen)離效(xiao)果也很重(zhong)要(yao)，在氣(qi)相條件探索過程中(zhong)，比較了AC—5（非極性(xing)）和DB—17（中(zhong)極性(xing)）兩(liang)種(zhong)毛細管色(se)(se)譜(pu)柱，發(fa)現AC-5 出(chu)峰(feng)慢，分(fen)(fen)(fen)離不徹底，而DB—17 在較低(di)溫度下很快就(jiu)能(neng)出(chu)峰(feng)，而且不同單糖(tang)峰(feng)形對(dui)稱，分(fen)(fen)(fen)隔(ge)較開，效(xiao)果很好，于(yu)是(shi)(shi)選擇(ze)DB—17作為分(fen)(fen)(fen)析色(se)(se)譜(pu)柱。