為(wei)了得(de)到發酵(jiao)石(shi)榴(liu)汁(zhi)的優良菌種，并確定石(shi)榴(liu)酒發酵(jiao)的工藝參數(shu)，從自然發酵(jiao)的石(shi)榴(liu)酒醪中分離、純(chun)化石(shi)榴(liu)酒酵(jiao)母菌種；通過單因素和正(zheng)交試驗(yan)，確定石(shi)榴(liu)酒發酵(jiao)的工藝參數(shu)。

　　結果發現，分離純(chun)化(hua)的(de)(de)菌種經形(xing)態特征和26S rDNA D1/D2 區域序列分析鑒定(ding)為(wei)釀(niang)酒酵母。由此(ci)確(que)定(ding)的(de)(de)最(zui)佳工藝條件為(wei)：溫度(du)28℃、pH 3.8、糖(tang)度(du)為(wei)17%、二氧(yang)化(hua)硫的(de)(de)添加量為(wei)100 mg/L，最(zui)終發酵的(de)(de)石榴酒的(de)(de)酒度(du)在10%VoL左右。

    　石榴(liu)酒(jiu)是以石榴(liu)為原料，經剝皮、榨(zha)汁(zhi)、發(fa)酵、澄(cheng)清、陳釀(niang)而(er)成的果酒(jiu)。其色澤(ze)光亮透明(ming)，酒(jiu)體純正，酸甜爽口，保(bao)(bao)留了石榴(liu)酸、甜、澀、鮮之天然風味，含有大(da)量氨基酸、多(duo)種維生(sheng)素等，具有很高的營養價值，并有生(sheng)津化食、健脾益胃、降(jiang)壓降(jiang)脂、軟化血管、保(bao)(bao)健美(mei)容及止瀉之功效。

　　經發酵過(guo)的(de)石(shi)榴(liu)汁抗(kang)氧化活性與丁基羧基茴香醚（BHA）相近(jin)，明顯高(gao)于(yu)紅(hong)葡萄(tao)酒(jiu)。中國(guo)石(shi)榴(liu)種植面積迅速擴(kuo)大，尤其是河南(nan)滎陽、衛輝(hui)等地(di)形成了(le)大的(de)石(shi)榴(liu)園，產(chan)量已具規(gui)模，但是石(shi)榴(liu)不耐儲藏，除鮮食外，每年都有許多果(guo)(guo)實因不能及時消費和(he)加工而浪(lang)費，特(te)別(bie)是小果(guo)(guo)和(he)裂果(guo)(guo)。

    　近年來，從天然(ran)石(shi)(shi)榴(liu)(liu)汁中分(fen)離得到(dao)了(le)一株高效發(fa)酵(jiao)石(shi)(shi)榴(liu)(liu)酒的(de)菌株，通過形態特征和26S rDNAD1/D2 區(qu)域序列分(fen)析鑒(jian)定(ding)為釀酒酵(jiao)母系列。對其發(fa)酵(jiao)工(gong)藝參數進行(xing)優化(hua)，獲得了(le)酒體純正生物功效高的(de)石(shi)(shi)榴(liu)(liu)酒生產(chan)最(zui)佳工(gong)藝，并探(tan)討了(le)石(shi)(shi)榴(liu)(liu)的(de)綜合利用，增(zeng)加(jia)(jia)了(le)石(shi)(shi)榴(liu)(liu)及其他(ta)相(xiang)關農產(chan)品的(de)附加(jia)(jia)值。對提(ti)高石(shi)(shi)榴(liu)(liu)經濟效益，保護和發(fa)展石(shi)(shi)榴(liu)(liu)產(chan)業有著非常重要的(de)意義。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

    　石(shi)(shi)榴：購自河南(nan)省(sheng)新鄉市衛輝。菌種：從(cong)石(shi)(shi)榴汁自然發酵醪中分離。分離及保藏培養基：馬鈴薯(shu)20%，蔗(zhe)糖1%，石(shi)(shi)榴汁40%，瓊脂2%。菌種鑒定材料：引物(wu)(wu)NL1（5’—GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG—3’）和(he)NL4（5’—GGT CCG TGT TTC AAG ACG G—3’），由(you)上海生工(gong)生物(wu)(wu)工(gong)程(cheng)技術服務有限公司合成(cheng)。酵母基因組DNA提取試劑盒（Solarbio 公司），PCR buffer、Tag 酶、dNTP（寶(bao)生物(wu)(wu)工(gong)程(cheng)（大(da)連(lian)）有限公司）。

    　1.2 主(zhu)要儀(yi)器

    　PCR儀(yi)為T—Gradient （德國Biometra公司）。

    　1.3 方法(fa)

    　1.3.1 菌源(yuan)的(de)制(zhi)備取壓榨好的(de)石榴全汁置室溫進行自然發酵(jiao)，使石榴汁內的(de)酵(jiao)母大量(liang)(liang)繁殖，待有(you)大量(liang)(liang)氣泡并有(you)較濃酒(jiu)味產生(sheng)時，即(ji)可供分離石榴酒(jiu)菌源(yuan)。

    　1.3.2 菌(jun)(jun)種的分離、純化(hua)(hua)取上述發(fa)酵好的石榴酒醪進行梯度稀釋，均勻涂布至分離用(yong)的瓊脂培(pei)養(yang)基上，22℃—24℃恒溫培(pei)養(yang)36h，挑單菌(jun)(jun)落培(pei)養(yang)直至純化(hua)(hua)。

    　1.3.3 菌種的(de)鑒(jian)定(ding)純化后(hou)的(de)菌株(zhu)經菌落形態觀察和(he)鏡(jing)檢，初步(bu)確定(ding)為酵母菌。同時，根(gen)據酵母菌分類(lei)學(xue)研究標準方法做分子鑒(jian)定(ding)。酵母核基(ji)(ji)因組(zu)的(de)提(ti)取(qu)使用酵母基(ji)(ji)因組(zu)DNA提(ti)取(qu)試劑盒，按(an)照說明書操作(zuo)。

　　使用(yong)引物(wu)NL1和NL4進行26S rDNA D1/D2區的擴(kuo)增。PCR 反應液(ye)的組(zu)成（采(cai)用(yong)50μL體系）：每管(guan)中含PCR緩沖液(ye)（10×）5.0μL；25mmol/LMgCl2 3.0μL；10mmol/LdNTP1.0μL；10μmol/LNL1 和NL4 各1ul；0.5 U/ul DNA 聚合酶0.3 μL；10ng/ul —1000ng/ul 模板DNA1.0μL；最(zui)后(hou)(hou)添加ddH2O 定容50μL。PCR循環次序為：95℃預(yu)變性5min，94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min20s；循環36次；再(zai)72℃延伸8 min。PCR產物(wu)經(jing)1%瓊(qiong)脂糖(tang)凝膠電泳檢(jian)測后(hou)(hou)，由(you)英俊生物(wu)技術有(you)限公司(si)測序。

    　1.3.4 發酵工(gong)藝的確定(ding)

       發酵溫度的確定。
　　將石榴汁的(de)糖(tang)度(du)調(diao)整為19%，pH調(diao)為4.0，添加SO2量(liang)為80mg/L。接種(zhong)等量(liang)的(de)石榴酒(jiu)酵(jiao)母(mu)，分別置于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃5個溫度(du)梯度(du)下培養。待(dai)不再有氣泡產生時停止(zhi)發酵(jiao)，用來測定其殘糖(tang)和(he)酒(jiu)精度(du)。

    　發酵pH的確定。

　　將(jiang)石榴(liu)汁的糖(tang)度(du)通過添(tian)加(jia)蔗糖(tang)調整為19%，添(tian)加(jia)SO2量為80mg/L，調pH分(fen)別(bie)為3.8、4.1、4.4、4.6、4.8，接種(zhong)等量的石榴(liu)酒酵(jiao)(jiao)母(mu)，置于28℃下發酵(jiao)(jiao)。待不(bu)再(zai)產生氣泡時(shi)停止發酵(jiao)(jiao)，測定其殘糖(tang)和(he)酒精度(du)。

    　不同糖(tang)濃度發酵的(de)試驗。

　　利用(yong)蔗糖，將石榴(liu)汁的糖度分(fen)別調(diao)(diao)整為(wei)13%短文源華廈酒(jiu)報、15%、17%、19%、21%5個梯度，添加SO2量(liang)為(wei)80mg/L，調(diao)(diao)節(jie)pH為(wei)4.0，接種等量(liang)的石榴(liu)酒(jiu)酵(jiao)(jiao)母。置于28℃下發(fa)酵(jiao)(jiao)。待不再產生(sheng)氣(qi)泡時停止發(fa)酵(jiao)(jiao)，測定(ding)其殘(can)糖和(he)酒(jiu)精度。

　　SO₂添加量的確定。

　　將石榴汁糖度調整為19%，pH調為4.0，分別選擇SO2的添加量為40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L。接種等量石榴酒酵母，置于28℃下發酵。待不再產生氣泡時停止發酵，測定其殘糖和酒精度。正交試驗因素水平測試。以溫度、pH、糖度、SO₂的添加量為因素(su)，進(jin)行L9（34）正交試(shi)驗(yan)（見表(biao)1），以確(que)定各因素(su)的最佳用量。

　　2 結果與分析

　　2.1 石榴酒酵(jiao)母的分(fen)離鑒定

　　從自然(ran)發酵的(de)(de)石榴(liu)酒醪中(zhong)(zhong)分離出的(de)(de)酵母(mu)的(de)(de)菌(jun)(jun)落(luo)形(xing)態可以看出，所分離菌(jun)(jun)種(zhong)的(de)(de)菌(jun)(jun)落(luo)形(xing)態特(te)征為：菌(jun)(jun)落(luo)乳(ru)白色，圓(yuan)形(xing)較大，中(zhong)(zhong)間突起(qi)，濕(shi)潤(run)有光澤，邊(bian)緣(yuan)成浸潤(run)狀。經(jing)鏡檢其細胞為橢圓(yuan)型(xing)，能(neng)進行出芽繁殖，符合果(guo)酒酵母(mu)的(de)(de)典型(xing)特(te)征。

　　經(jing)BLAST分析及序列相似性計算，所分離出的被(bei)測菌株的26S rRNAD1/D2 區基(ji)因序列與模(mo)式菌株（U44806）同源性為(wei)(wei)99.4%，被(bei)鑒定(ding)為(wei)(wei)釀(niang)酒酵母。

　　2.2 發(fa)酵條件單(dan)因素(su)試驗(yan)結果

　　在適宜的(de)溫(wen)度、pH、糖濃度下，酵母菌的(de)生長(chang)繁殖和代謝速度都很迅速，較(jiao)低的(de)pH還(huan)可以(yi)保證添(tian)加的(de)SO2以(yi)較(jiao)多(duo)的(de)游(you)離態存在，更好地起(qi)到抑制有害微生物的(de)作(zuo)用。因此，試(shi)驗(yan)對上述(shu)參數進(jin)行了單因素試(shi)驗(yan)。

    　通過發(fa)酵(jiao)過程觀(guan)察發(fa)現(xian)，發(fa)酵(jiao)溫度(du)高(gao)，發(fa)酵(jiao)完(wan)成快，殘糖高(gao)，酒(jiu)精(jing)(jing)度(du)低，果酒(jiu)風味不足；發(fa)酵(jiao)溫度(du)低，發(fa)酵(jiao)完(wan)成較慢，殘糖低，酒(jiu)精(jing)(jing)度(du)也高(gao)。

　　從不同溫度(du)(du)下發酵樣品的殘糖和(he)酒精度(du)(du)結果來看，26℃是最適的發酵溫度(du)(du)。

　　由(you)不(bu)同(tong)pH下(xia)發(fa)(fa)酵樣品的(de)(de)(de)殘(can)(can)糖(tang)和酒(jiu)(jiu)精度的(de)(de)(de)結果可以看出，不(bu)同(tong)pH對石(shi)榴(liu)(liu)(liu)酒(jiu)(jiu)發(fa)(fa)酵結束的(de)(de)(de)殘(can)(can)糖(tang)幾乎沒有影(ying)響(xiang)(xiang)，在pH4.6時(shi)(shi)(shi)殘(can)(can)糖(tang)較低(di)(di)，但(dan)酒(jiu)(jiu)精度也(ye)低(di)(di)。在pH3.8時(shi)(shi)(shi)產酒(jiu)(jiu)精度最(zui)(zui)高，在pH超過4.4時(shi)(shi)(shi)雖然也(ye)能達到(dao)(dao)相(xiang)同(tong)的(de)(de)(de)酒(jiu)(jiu)精度，但(dan)發(fa)(fa)酵后(hou)石(shi)榴(liu)(liu)(liu)酒(jiu)(jiu)的(de)(de)(de)顏(yan)色(se)發(fa)(fa)黃，失去了原本的(de)(de)(de)深紅色(se)，影(ying)響(xiang)(xiang)石(shi)榴(liu)(liu)(liu)酒(jiu)(jiu)的(de)(de)(de)外觀效果。因(yin)此，確定石(shi)榴(liu)(liu)(liu)酒(jiu)(jiu)酵母發(fa)(fa)酵的(de)(de)(de)最(zui)(zui)適(shi)為pH3.8。由(you)不(bu)同(tong)糖(tang)濃度下(xia)發(fa)(fa)酵的(de)(de)(de)樣品的(de)(de)(de)殘(can)(can)糖(tang)和酒(jiu)(jiu)精度的(de)(de)(de)結果可以看出，隨(sui)著發(fa)(fa)酵初糖(tang)的(de)(de)(de)提高，發(fa)(fa)酵結束時(shi)(shi)(shi)的(de)(de)(de)殘(can)(can)糖(tang)也(ye)隨(sui)之增加，而最(zui)(zui)終酒(jiu)(jiu)精度也(ye)逐漸隨(sui)之增加，在糖(tang)度為19%時(shi)(shi)(shi)達到(dao)(dao)最(zui)(zui)大，而后(hou)又開始下(xia)降。

    　因此，并不是(shi)糖(tang)(tang)度越(yue)(yue)高(gao)(gao)，酒精(jing)的(de)轉化率就越(yue)(yue)高(gao)(gao)，過(guo)高(gao)(gao)的(de)糖(tang)(tang)度可能(neng)(neng)會抑(yi)制酵(jiao)母(mu)菌(jun)對糖(tang)(tang)的(de)利用。這(zhe)可能(neng)(neng)是(shi)糖(tang)(tang)度過(guo)高(gao)(gao)時(shi)，酵(jiao)母(mu)菌(jun)所處環境的(de)滲(shen)透壓(ya)超出了其(qi)所耐受(shou)的(de)能(neng)(neng)力(li)，從而抑(yi)制了其(qi)生理(li)活動。

　　從試驗結果來看，石榴酒酵母發酵的最適糖度為19%。在果酒釀造過程中都會添加一定量的SO₂，起到抑制雜菌、護色、澄清、增酸和改善口味等作用。但添加過多會影響酒的風味、抑制酵母菌的發酵及出現酒液中殘留硫量超標等危害。由SO₂對石榴酒發酵結束的殘糖和酒精度的影響可看出，SO₂對石榴酒發(fa)酵結束時的殘糖濃度(du)(du)幾乎沒有影(ying)響，對最終(zhong)酒精(jing)度(du)(du)的影(ying)響也(ye)較(jiao)小，均(jun)為(wei)6%左右，而添加量為(wei)80mg/L 時酒精(jing)度(du)(du)稍(shao)高(gao)一點(dian)，為(wei)6.1%。

    　2.3 正交試驗結果

    　發酵溫度、pH、糖度（%）和(he)SO2的添(tian)加(jia)量（mg/L）4因(yin)素正交(jiao)試驗結果見表2。

　　由表2 可以看出，對酒精度影響程度的主次順序為糖度（C）＞ 溫度（A）＞pH（B）＞SO2的添加量（D），即糖度、溫度和pH 對石榴果酒的酒精度影響較大，而SO2的添加量對石榴酒酵母發酵的影響較小，其最優方案為A₂B₁C₁D₃，即溫度為28℃，pH為3.8，糖度為17%，SO₂的添加量為100mg/L時，石(shi)榴(liu)酒酵母(mu)發(fa)酵石(shi)榴(liu)汁產酒度最(zui)好(hao)。

    　3 結論

    　研究從自然發酵的石榴酒(jiu)醪里(li)分離出(chu)了一株能高(gao)效發酵石榴汁的酵母菌種(zhong)，通(tong)過基因組分析初(chu)步鑒定(ding)為(wei)釀酒(jiu)酵母。

　　通過正(zheng)交優化試驗，獲得了最佳石榴(liu)酒釀造(zao)條件，并(bing)確定了釀造(zao)過程(cheng)中影響酒精度因素為(wei)糖度＞溫度＞pH＞二氧化硫添加量。

　　石榴酒艷若朝霞，果(guo)(guo)香純正(zheng)，優雅，更因其獨(du)特的食療保(bao)健作用，極具發展(zhan)(zhan)潛(qian)力，發展(zhan)(zhan)果(guo)(guo)酒符(fu)合(he)國家產業政策的要求。而做好研(yan)究為石榴酒規模(mo)生產提供(gong)了重要參(can)考(kao)。大力發展(zhan)(zhan)石榴果(guo)(guo)樹(shu)栽培，選育優良品種，對開發石榴酒等系(xi)列(lie)產品很(hen)重要。